Поврежденные глаукомой нейроны сетчатки впервые заставили регенерировать. Этого результата добились ученые из Америки благодаря технологии частичного репрограммирования. Биологи ввели в глаза мышей вирусные векторы с генами факторов Яманаки, которые не перевели нейроны в зародышевое состояние, но восстановили их работоспособность. То же самое удалось сделать с пожилыми животными. Факторы Яманаки вернули им остроту зрения. Ход исследования описан в издании Nature.
Вероятно, что за омолаживающий эффект отвечает деметилирование. Под действием факторов Яманаки в клетках восстанавливается “молодой” набор эпигенетических меток на ДНК. Каким образом клетка помнит, какой набор клеток соответствует ее молодости, пока неизвестно.
Один из методов отличить старые клетки от молодых — взглянуть на набор эпигенетических маркеров, то есть метильных меток на ДНК и гистоновых белках, на которые эта ДНК накручена. Со временем одни гены находят эти метки, а другие, наоборот, теряют. Так, в клетке меняется комплекс генов, которые доступны для считывания информации. Стареющая клетка теряет свои свойства именно поэтому. Например, она утрачивает способность делиться или избавляться от молекулярного мусора. Благодаря этому набор меток на ДНК, которые называют “эпигенетическими часами”, позволяет определить биологический возраст человека.
До сих пор нет действенных способов его снижения (если не учитывать тот случай, когда участники клинического испытания, нацеленного на восстановление функции тимуса, за год эксперимента стали на два года моложе эпигенетически), зато можно «обнулить» эпигенетический возраст для отдельных клеток. Этого можно добиться благодаря технологии репрограммирования, за которую в 2012 получил Нобелевскую премию Синъя Яманака. Клетки вводят факторы Яманаки, которые превращают их из дифференцированных в стволовые, аналогичные клеткам на ранних стадиях эмбриогенеза — и эпигенетический возраст тоже начинает соответствовать зародышевому состоянию.
Применить эту технологию к целому организму гораздо труднее. Для того чтобы сделать организм моложе, не нужно превращать его клетки в зародышевые. Это может повлечь отрицательные последствия — из них могут вырасти опухоли, а свои функции они при этом растеряют. Эту проблему могло бы решить частичное репрограммирование — например, когда факторы транскрипции вводят в клетки на небольшое время.
Вторая трудность состоит в том, чтобы подействовать на все клетки организма одновременно. Этого результата удалось добиться на преждевременно стареющих мышах, которым с помощью репрограммирования продлили жизнь на 30 %. Но для этого мышей пришлось генетически модифицировать — то есть встроить гены факторов Яманаки в геном мышей. Это нужно для того, чтобы можно было запускать их работу по сигналу извне.
С людьми эта технология вероятнее всего не сработает. К тому же на сегодня генетически их модифицировать запрещено. Поэтому группа ученых из Гарвардской медицинской школы решила попробовать другую методику.
Специалисты создали аденовирусный вектор, который должен был доставить в клетки мышей гены трех факторов Яманаки (четвертый, как наиболее онкогенный, было решено исключить). Это позволяет не модифицировать организм целиком, а ввести гены в отдельные исследуемые клетки. При этом все три гена находились под контролем промотора, который запускается только под действием препарата доксициклина. Так авторы исследования смогли запускать и тормозить работу факторов Яманаки извне — просто добавляя животным доксициклин в питьевую воду.
Сначала ученые проверили, что эта методика является безопасной: они вводили свой вектор и молодым (5 месяцев) и пожилым (20 месяцев) мышам и периодически активировали работу факторов Яманаки, но не заметили отличий от контрольных животных ни в состоянии здоровья, ни в количестве опухолей.
Позже специалисты решили протестировать свою методику омоложения клеток на ганглионарных клетках сетчатки. Это нейроны, по отросткам которых нервные импульсы от глаза поступают в мозг. Они отличаются тем, что могут регенерировать и отращивать новые аксоны у зародышей и новорожденных, но теряют это свойство с возрастом — и поэтому повреждение зрительного нерва необратимо.
Мышам сначала впрыскивали внутрь глаза вирусные векторы и запускали работу факторов Яманаки доксициклином, потом повреждали зрительный нерв, а затем вводили красители, которые помечали растущие аксоны. Выяснилось, что под действием факторов Яманаки число регенерирующих аксонов увеличивается почти в 5 раз — но только тогда, когда вектор содержал все три фактора. По одиночке они оказывали гораздо более слабый эффект. Причем запустить регенерацию удалось как у молодых (1 и 3 месяца), так и у пожилых (12 месяцев) мышей. Похожие результаты авторы работы получили и на человеческих нейронах — правда, только in vitro.
Затем ученые проверили, можно ли с помощью этого метода восстановить зрение в поврежденном глазу у мышей. Им вводили микрогранулы в переднюю камеру глаза, чтобы повысить давление и вызвать глаукому. После этого в стекловидное тело впрыскивали аденовирусные векторы с факторами Яманаки и на 4 недели запускали их работу доксициклином, а затем измеряли остроту зрения мышей. За месяц лечения репрограммированием исследователям удалось «отыграть» около половины потери остроты зрения у мышей — и, кажется, это первый пример восстановления зрения после травмы нерва при глаукоме.
Наконец, они проверили такую технологию и на стареющих (11 месяцев) мышах, у которых острота зрения уменьшается даже в отсутствие глаукомы. Выяснилось, что и у них введение факторов Яманаки позволяет улучшить зрение — причем настолько, что оно становится неотличимо (p = 0,814) от зрения молодых (3 месяца) мышей. А это уже означает, что репрограммирование можно использовать для того, чтобы обратить возрастные изменения, даже не связанные с конкретной болезнью. И теоретически эта методика могла бы сработать и у людей — поскольку глаз отделен от основного кровотока прочными барьерами, и аденовирусные векторы, введенные внутрь глаза, могут не попасть в остальные органы (поэтому именно в глазу человека впервые попробовали имплантацию репрограммированных клеток, а также генетическое редактирование in vivo).
Затем ученые решили выяснить, как в ходе этих процессов изменяется метилирование ДНК. Они измерили эпигенетический возраст нейронов по набору меток на рибосомальных генах и заметили, что травма зрительного нерва повышает возраст клеток, а работа факторов Яманаки, напротив, его снижает. При этом когда в нейронах заблокировали работу деметилаз — белков, которые снимают метки с ДНК — регенерировать они не смогли. Значит, для того, чтобы вернуть нервным клеткам способность отращивать аксоны, необходимо снизить их эпигенетический возраст.
Однако в исследовании со стареющими здоровыми мышами никакой травмы глаза не было, и нервные клетки не нуждались в новых отростках. Значит, там факторы Яманаки и деметилирование смогли изменить что-то в самой физиологии клеток и вернуть им прежнюю работоспособность. И действительно, исследователи подсчитали, что в стареющих ганглионарных клетках изменяется экспрессия 464 генов, и 90 процентов из них возвращаются на «молодой» уровень после введения факторов Яманаки.
Так ученым удалось обнаружить, что репрограммирование клеток может каким-то образом вернуть их в молодое состояние, не превращая их в стволовые. При этом они не теряют прежних функций и работоспособности, но «перезагружают» свои эпигенетические метки на ДНК. Но коль скоро клетка может вернуться к «молодому» эпигенетическому состоянию, это означает, что оно где-то должно быть «записано». Авторы работы отмечают, что у них нет ответа на этот вопрос, а есть лишь предположения — что это «исходное состояние» может как-то кодироваться другими модификациями ДНК, изменениями хроматина или ДНК-связывающими белками. Но если его удастся так или иначе обнаружить и декодировать, то возможно, мы научимся снижать эпигенетический возраст и в других тканях и органах, а не только в отдельно взятых нейронах глаза.
Технологии репрограммирования только начинают использоваться медицине. На людях их применяют нечасто, хотя известны отдельные случаи, когда пациентам пересаживали роговицу из репрограммированных клеток или даже предшественники нейронов — чтобы затормозить болезнь Паркинсона. А с мышами ученые активно проводят исследования: например, недавно удалось превратить клетки нейроглии в полноценные нейроны, а селезенку — в работоспособную печень.
