Изменения, которые внесли в ген взрослых макак, помогли снизить у животных уровень холестерина в крови прошли успешно, об этом отчитались сразу две группы исследователей. На основе метода CRISPR/Cas редактор нуклеотидных оснований позволил внести однонуклеотидные мутации и «сломать» один из генов. Направить действие механизма в один орган, а именно печень помогла доставка конструкции при помощи липонаночастиц. В Nature Biotechnology была опубликована одна из работ, в Nature разместили другую.
Терапевтический подход к редактированию генов живых существ только появляется и с его помощью исследователи хотят начать изменения ДНК в организмах пациентов. У ученых среди уже созданных молекулярных инструментов очень популярными являются нуклеазы – это ферменты, разрывающие связь между соседними нуклеиновыми кислотами CRISPR—Cas9 и —Cas12, но также CRISPR-редакторы нуклеотидных оснований — аденина и цитозина.
Перед нуклеазами редакторы обладают одним важным преимуществом: им не нужно разрушать связи между соседними нуклеотидами и нарушать целостность двух цепочек ДНК, для того чтобы внести определенную мутацию. Под действием фермента деаминазы происходит однобуквенная замена пары аденин-тимин на гуанин-цитозин. В одной цепи ДНК этот фермент будет заменять аденин на инозин, воспринимающийся полимеразами как гуанин. После чего система занимается одноцепочечным разрывом во вторую цепь, и система репарации подставляет аденин.
Биологов интересует даже внесение одной небольшой замены, а именно: из замены пары Г-Ц на А-Т состоит большинство патогенных природных мутаций. Помочь отключить ген может даже одна замена, только этот ген будет работать очень активно, как пример – ген PCSK9, он экспрессируется по большей части в печени и служит одним из регуляторов экспрессии рецепторов липопротеинов низкой плотности (ЛПНП-рецепторов).
К повышенному содержанию в крови холестерина приводят мутации, которые повышают эффективность PCSK9 у людей. Также иногда у 2-3% людей появляются мутации, нарушающие функции PCSK9. Из этого следует, что в крови идёт понижение уровня липопротеинов низкой плотности, а это снижает риск атеросклероза и вреда для здоровья человека от данной мутации нет. В теории внесение всего одной мутации в этот ген может помочь людям на долгий срок снизить уровень холестерина в крови (может даже навсегда).
Независимо друг от друга сразу две группы исследователей сделали описание результатов, которые были получены в ходе опытов над нечеловеческими приматами, благодаря помощи CRISPR-редакторов адениновых оснований исследователи из Цюрихского университета под руководством Геральда Шванка (Gerald Schwank) и компании Verve Therapeutics под руководством Секара Катхиресана (Sekar Kathiresan) добавили однонуклеотидные мутации в ген PCSK9 у макаков-крабоедов.
Такие регионы в PCSK9 определили обе группы, ведь в них мутация приведёт к нарушению сплайсинга (созревания) соответствующей мРНК. Сначала ученые проверили на клеточных культурах человеческих гепатоцитов и мышиных моделях то, что мутация действительно занимается снижением экспрессии гена.
Липонаночастицы использовали ученые из Verve Therapeutics для того, чтобы доставить мРНК аденинового редактора и годовую РНК в клетки печени макак. У макак повышался уровень маркеров повреждения печени в крови сразу после введения частиц, но приходил в форму уже через пару недель. Эффективность редактирования составила 53% спустя две недели, но в крови уровень белка PCSK9 упал на 65%. Важно также знать, что адениновая замена прошла в основном в печени.
В селезенке эффект был менее заметен, но совсем незаметен в других органах. Дозой, при которой идёт достижение максимальной эффективности редактирования и минимального уровня PCSK9 в крови является один миллиграмм частиц на килограмм веса животного, сообщают ученые.
Для того чтобы проверить переносимость животными этой терапии, исследователи из этой группы начали эксперименты. Когда была написана статья у макак наблюдался сниженный уровень PCSK9 в крови на протяжении 8 месяцев, а ещё сниженный на 60% холестерин. И при этом отсутствие отрицательного влияния на здоровье животных.
Подобные эксперименты провела группа учёных из Цюрихского университета. Не только разные дозировки средства тестировали исследователи, но и различные режимы введения: определенная часть животных получала пару введений с разницей в 2 недели. 27,6±5,87 процента целевых нуклеотидов удалось отредактировать, добавочная доза эффективность не повысила. Авторы остались довольны точностью метода, а именно 88% всех изменений, которые были вызваны CRISPR-редактором. О куда меньшем снижении уровня холестерина в крови заявляют ученые из этой группы, на 9-19%. (По сравнению с другими результатами своих коллег).
Реагирует ли иммунитет животных на чужеродный белок, также провели проверку авторы второй работы. Приматам, в отличие от мышей повторное введение эффективность не повысило, ученые решили, что их организм просто блокирует действие редактора. У получивших терапию макак антитела, специфичные к белкам-редакторам, действительно были найдены. Ученые уверены, что эффективность к терапии повысится, если в другой раз ввести дозу до того, как сформируется иммунитет к белкам.
Отсутствие значимых побочных эффектов и небольшую нецелевым активность системы отметили обе группы в целом. Когда-нибудь альтернативой существующим методам сможет стать подобная тактика по снижению холестерина, надеются ученые. Также доставка липонаночастицами конструкций с белками для замены нуклеотидов вполне может помочь и с борьбой с другими генетическими заболеваниями. Поскольку на данный момент решение этих проблем – это трансплантация печени.
Не так давно исследователи смогли создать сам инструмент для починки точечных мутаций на основе технологии CRISPR/Cas. Но уже был протестирован в лаборатории редактор нуклеотидных оснований на эмбрионах как средство от талассемии, и с его помощью удалось спасти мышей от прогерии.
